바이러스 탐지가 가능한 Real time PCR 기술법 소개

어서 오세요~ 힐링 만다린입니다:)

 

근래 우리나라에서 최대 관심사 이자 최대 우려하는 점이 '코로나 19'의 확산과 대책 건이라고 생각 드는데요.

TV를 틀어 어떤 채널을 돌려보아도 코로나 19 확진자 수의 증가와 사망, 유증상자에 대한 이야기뿐입니다.

뉴스와 SNS를 통해 코로나 19가 바이러스의 한 종류이며, 호흡기 질환을 유발한다는 점 다들 알고 계실 겁니다.

코로나 19에 감염되어 미열과 호흡기 질환의 이상을 느끼는 유증상자들에 대한 진단이 신속하게 이뤄지고 있는데 진단 결과는 코로나 바이러스 '양성' 판정과 '음성' 판정으로 나뉩니다. 

 

어떤 기준으로 양성과 음성 판정의 결과가 나오는 걸까요?

한 논문에서 발취한 내용을 보면 Real-Time PCR이 바이러스를 탐지하는데 가장 정확하면서 정밀한 방법이라고 이야기합니다. Taqman assay PCR 혹은 digital PCR이 바이러스를 탐지하는 연구 분야에 지속적으로 응용되면서, 최근(주)솔젠트 회사가 코로나 19 진단키트 수출 계약 체결로 해외 판매를 본격화하고 있다는 뉴스가 보도되었습니다. 

 

솔젠트 회사의 코로나 19 진단키트를 살펴보니, Real-time PCR 기술을 활용한 키트였습니다.

이렇게 바이러스는 사람의 검체로부터 추출된 핵산; DNA 혹은 RNA를 이용하여  Real-Time PCR로 다중 분석과 2시간 이내에 정확하고 신속한 진단을 진행합니다. 만약 사람의 검체에 바이러스의 핵산이 존재하지 않으면 PCR 결과에서 신호가 나오지 않아 음성 판정을 받게 되고, 검체에 바이러스 핵산이 존재한다면 PCR 결과의 신호를 보여 양성 판정을 받게 됩니다.

 

바이러스 연구에 가장 많이 사용되는 기술이 Real-time PCR 이라고 하는데 그렇다면 이 기술은 과연 무엇일까요?

PCR은 중합효소 연쇄반응이라 하여 원하는 DNA의 서열을 서로 다른 온도 단계에 따라 증폭시키는 기술입니다.

앞에 REAL-TIME이 붙어있습니다. 말 그래도 실시간으로 PCR의 결과를 확인할 수 있는 기술입니다.

기존 PCR은 PCR로 증폭된 산물을 전기영동법으로 산물의 밴드 유무를 확인합니다. 민감도와 해상도가 낮고 정량적인 분석이 어려우면서 두 번의 실험 과정을 거치게 되므로 오랜 시간이 걸리는 기술입니다. 하지만 Real-time PCR은 사람의 검체에서 추출된 핵산을 PCR 준비물과 함께 섞어 증폭 단계를 거치면서 target 하는 핵산이 있으면 증폭되고, 그 증폭산물들을 실시간으로 확인할 수 있는 높은 민감도와 특이도를 갖는 기술입니다.

 

증폭하는 것을 어떻게 실시간으로 확인할 수 있는 건가요?

그 이유는 바로 형광 물질 때문입니다.

형광 물질은 쉽게 말해 형광을 발현하는 물질로, real-time PCR 진단 키트에 포함되어 있는 PCR 준비물들 중 한 요소입니다.

SYBR green과 Taqman probe 2가지가 주로 이용되며, SYBR green은 초록색의 형광을 띄고 있는 형광물질이라 생각하시면 됩니다. 단일가닥의 DNA 혹은 RNA가 Primer와 붙어 이중가닥이 되면 녹색 형광물질인 SYBR green이 이중가닥 사이로 들어가 형광을 내게 됩니다. 증폭된 산물이 하나이면 하나의 형광 크기가 나타날 것이고 증폭이 계속 진행되면 2개, 10개, 100개로 이중가닥이 만들어짐에 따라 SYBR green이 계속해서 증폭되는 이중가닥에 삽입되어 2개의 형광 크기, 10개의 형광 크기, 100개의 형광 크기를 발현하게 됩니다. (SYBR green은 단일가닥에는 삽입되지 않기 때문에 형광을 발현하지 못합니다.)

여기서 잠깐, SYBR green은 primer와 결합한 이중가닥 외의 원하지 않는 증폭산물 혹은 이상한 조합으로 이루어진 이중가닥에도 모두 끼어들어가는 '낄낄 빠빠'를 하지 못하는 형광물질이어서 정확도가 떨어집니다. 그래서 바이러스와 같은 민감한 검체 그리고 정확한 진단이 필요한 경우에는 Taqman probe를 이용하여 고정밀의 real-time PCR을 만듭니다.

Taqman probe는 5번 말단에 형광 물질이 붙어 있고 3번 말단에는 quencher라는 형광을 죽이는 물질이 붙어 있습니다. 그래서 형광물질이 quencher와 함께 있을 때는 형광을 내지 못하다가 정확하게 primer와 결합한 핵산에서는 형광물질이 떨어져 나가면서 quencher와 분리되어 고유한 파장을 나타내며 형광을 내게 됩니다.

 

형광 물질이 발현하면서 실시간으로 PCR의 결과를 확인하면 위와 같은 그래프를 모니터에서 볼 수 있습니다. S자 곡선의 그래프가 보이는데 가로축은 증폭하는 PCR의 횟수(cycle)를, 세로축은 fluorescence로 형광의 세기를 의미합니다. 이 그래프는 에서 Cq value가 바로 우리가 확인하고자 하는 검체에 포함된 바이러스의 양 혹은 다른 병원균이나 보고자 하는 물질의 양을 이야기합니다. 이 Cq를 통해 정량 분석이 가능하며 Cq가 앞으로 나올수록 즉 0~10 부근에 위치해 있을수록, 바이러스와 같은 균들이 굉장히 검체에 많아서 증폭이 초반부터 되어 형광물질들이 더 일찍 발현되는 것입니다. 반대로 Cq가 뒤에 있다면, 즉 숫자가 크게 나온다면(20~30) 검체에 원하는 물질들이 많지 않아 증폭이 늦어짐을 의미하게 됩니다. 만약 검체 안에 바이러스나 다른 균이 없다면 형광은 40 cycle이 지나갈 때까지 발현되지 않고 일직선을 그리게 됩니다. 이 것이 음성 판정이고, 양성 판정은 Threshold line(역치선) 위로 형광이 탁 올라가는 그 점을 읽고 진단하며, 검체를 정량 분석하게 됩니다.

 

코로나 19도 이와 비슷한 원리를 갖은 kit와 진단 방법으로 양성 판정과 음성 판정을 내리고 있을 것입니다. Real-time PCR 기술이 진단 기술에서는 정확도와 특이도가 높으며 시간도 오래 걸리지 않는 장점을 지니고 있으나, 이제는 더 이상의 코로나 확산이 없기를 바랍니다. 

 

그럼, 오늘 하루도 힐링하세요:)