Western & Northern &Southern blot이란

어서 오세요~ 힐링 만다린입니다 :)

 

Central dogma와 함께 DNA, RNA, 단백질의 정의를 알았다면, 오늘은 그들이 실제 세포에 존재하고, 얼마나 있을지를 정량 분석하는 방법들을 소개하려 합니다. 서쪽, 북쪽, 남쪽으로 해석할 수 있는 Western blot, Northern blot, Southern blot에 대해 이야기를 시작하겠습니다.

 

일반적으로 Blot의 실험 방법은 다음과 같습니다. 세포에서 추출물을 준비하고 전기영동 시킨 뒤, 크기별로 나누어지면 이들을 막으로 이동시킵니다. 막에는 단백질이든, 핵산이든 붙지 않는 부분이 존재할 수 있어 다른 균일한 물질들로 더 이상의 오염을 차단시키는 과정을 거칩니다. 그리고선, 항체 부착을 통해 원하는 물질을 검출합니다.  

 

첫 번째로 Western blot에 대해 설명하겠습니다. Western blot이란 특정 단백질의 유무 또는 양을 알기 위해 수행되는 분석방법입니다. 주로 단백질의 발현 여부를 알기 위해 사용되는데, 단백질-단백질 간의 특이성을 이용하여, 항원-항체 반응으로 진행됩니다.

 

나중에 항원-항체 반응에 대해 자세히 설명하겠지만 간단하게 항원이 무엇이고 항체가 무엇인지 집고 넘어가겠습니다. 항원이란 우리 면역체계에 들어와 면역력을 악화시키려는 적군을 이야기합니다. 이런 적군들이 들어왔을 때 방어해주는 막이 필요하겠죠? 그것이 항체입니다. 항체는 균형 잡힌 면역체계가 유지될 수 있도록 항원이 들어왔을 때 방어하는 분자를 말합니다. 앞서 말씀드렸다시피, Blot 방법은 기본적으로 항원-항체 특이 반응성이 이용됩니다. 검출하고 싶은 단백질의 epitope(입체 분자구조)와 완벽히 매칭 되는 항체를 이용하여 단백질과 항체의 특이적인 반응을 유도하고, 그 항체(1차 항체)가 잘 결합되었는지 눈으로 확인하기 위해 2차 항체로 1차 항체를 결합시킵니다. 보통 항체를 얻는 방법은 단백질을 토끼에서 주사해 혈액을 뽑았을 때, 토끼에게 이 단백질에 대한 항체가 생성됩니다. 그리고 이 토끼의 혈액(혈청)을 양에게 주사하게 되면 1차 항체에 대한 양의 2차 항체가 형성되게 됩니다. 이 1차 항체와 2차 항체를 이용하여 마지막 단계인 단백질을 검출합니다. 

 

Western blot의 기본 원리는, 세포의 추출물로부터 특정 단백질을 분석하기 위해 전기영동을 이용하여 크기별로 분리시키는 것입니다. 이 과정에서는 단백질을 순순하게 크기별로 분리하기 위해 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 실시해 단백질의 단위 질량당 charge와 3차원 구조를 모두 같게 해줍니다. SDS는 구조 끝에 sulfate가 붙어 있어, 단백질을 모두 단위 질량당 같은 정도의 (-) charge를 띠게 함으로써, 각 단백질들 간의 전하 차이를 제거하며, 동시에 3차 구조를 깨 드려 모양 차이로 인한 이동 속도의 변화를 없게 해 줍니다.이렇게 되면, 단백질은 순수하게 크기 별로 (-)음극에서 (+) 양극으로 이동하게 됩니다. 이렇게 단백질을 크기별로 분리해낸 후에 막으로 이동시킵니다. 이 역시 단백질의 전하 특성을 이용하여 (-) 음극 쪽에는 gel을 (+) 양극 쪽에는 막을 놓게 됩니다. 전기영동한 gel 자체에서 단백질을 검출하면 실험 방법을 간소화시킬 수 있겠다고 생각하겠지만, 단백질에 대응하는 항체가 gel안에는 쉽게 들어가지 못하기 때문에 항원이 결합 할 수 있는 막으로 이동시키는 것입니다. 막은 항체를 이용하여 확인할 때 더 편리하다는 장점 외에도, 겔을 다루는 것보다 용이하고, 염색이 빠르며, 장기간 보관할 수 있다는 장점들이 있습니다. 이렇게 크기 별로 분리된 단백질이 그대로 막에 이동하게 되어서 우리가 관심을 갖는 대상 단백질에 대한 항체를 이용하여 그 단백질을 검출할 수 있게 됩니다. 보통 검출을 할 때에는 ① 항체를 방사선 동위원소로 네이밍 시켜서 X-ray film을 이용해 찾는 방법이 있고, 다음으로 ② 항체에 형광 염색을 네이밍 시켜 형광 색소로 인한 발광을 이용하는 방법이 있으며, 마지막으로는 ③ 효소를 연결하는 방법이 있습니다.

 

 

Western blot은 특정 단백질의 항원성을 통해 확인가능하다는 점을 이용하여 단백질의 크기, 분자량을 확인할 수 있고, 소량의 단백질도 막으로 이동할 수 있기 때문에 좀 더 정밀한 분석이 가능하다는 장점이 있습니다. 또한 방사선 동위원소로 표지 되지 않은 복잡한 형태의 단백질 중에 특이한 단백질을 확인하고 정량하는데 유용하게 쓰입니다.

 

Northern blot은 분자 생물학 연구에서 시료의 RNA(또는 분리된 mRNA) 발견에 의한 유전자 발현을 연구하기 위한 기술입니다. 생물재료로부터 전사된 RNA를 변성시키고, agarose gel(아가로스 겔)에 전기영동하여 이것을 나이트로셀룰루로스 필터에 옮겨서 목적의 DNA단편을 probe로 교잡시키고, 그것의 위치와 양을 autoradiography로 검출합니다. 이 방법은 시료의 RNA-DNA 단편 간의 특이성을 이용하는데, 어떤 조직이나 세포의 유형이 특정한 유전자나 혹은 발현과정을 조절하는 인자들을 발현시키는지 알아내는데 응용되어집니다.

 

Southern blot은 DNA분자를 아가로오스 겔(Agrose gel)로부터 막으로 옮긴 후, 특정 DNA 서열(sequence)을 probe(탐침)로 이용하여 탐지하는 방법입니다. 이는 DNA-DNA 간의 특이성을 이용합니다. 

 

이 페이지에서는 핵산과 단백질을 정량 분석하는 방법들을 알아보았습니다. 이제부턴 분석 tool이 아닌 분석 tool을 이용하여 어떤 것들을 발견하였는지, 그 어떤 것들에 대해 소개하는 글들을 올리려 합니다.  

 

그럼, 오늘 하루도 힐링하세요:)