3세대 PCR : Digital PCR의 소개

어서 오세요~ 힐링 만다린입니다 :)

 

중합효소 연쇄반응인 PCR은 1세대, 2세대, 3세대 PCR로 나뉩니다. 말 그대로 3단계에 거쳐 PCR이라는 기술이 점차적으로 진보되었는데요. 오늘은 3세대 PCR인 digital PCR에 대해 소개하고자 합니다.

 

1세대 PCR은 Conventional PCR이라 부르며 PCR 후 증폭된 산물을 전기영동법을 통해 유전자의 정성 분석이 가능하도록 만든 시스템입니다. 증폭 산물의 밴드 유무에 따른 정성 분석이 가능하지만, 밴드의 양을 정량적으로 분석하기에는 어려움이 있습니다. 그래서 이 부분을 보완하기 위해 2세대 PCR이 개발되었습니다. 2세대 PCR은 Real-time PCR로 상대 정량 분석을 기반으로 정량적 및 정성적 분석이 가능한 기술입니다. Ct(Cq) 값을 통해 유전자의 발현량을 분석하는 데에 가능해졌습니다. 하지만 역시 Real-time PCR 또한, 절대 정량분석을 위해서는 표준 곡선이 필수적이며 PCR의 효율에 따라 결괏값에 편차가 생길 수 있다는 단점을 갖고 있습니다. 그래서 이러한 한계를 극복하기 위해 3세대 PCR이 도입되었습니다. 3세대 PCR은 Digital PCR로 표준 곡선을 그리는 과정이 필요 없으며, 오일 방울이나 microfluidic chip을 이용하여 PCR reagent 들을 많은 공간에 작게 작게 분포시켜 놓습니다.

 

높은 정확성과 감도 및 절대 정량화용으로 사용되는 디지털 PCR은 절대 정량화 및 희귀 대립유전자 검출을 위한 기존 정량 Real-Time PCR을 대체하는 새로운 핵산 검출 및 정량화 방법입니다. 디지털 PCR의 경우, 타깃 분자를 포함할 때 형광을 나타내는 양성 신호와 타깃 분자를 포함하지 않을 때 형광이 나타나지 않는 음성 신호 2가지를 갖고 있습니다.

 

 

3세대 PCR, 디지털 PCR은 다음과 같이 준비됩니다. 한 튜브 안에 20ul의 PCR 반응 물질들을 2만 개의 오일 방울로 쪼개어 증폭시킨 후, target DNA를 세는 시스템입니다. 좀 더 자세히 말하자면, gDNA, cDNA 혹은 RNA나 plasma를 PCR 준비물과 함께 tube에 준비한 뒤, 약 1nl 크기의 오일 방울 2만 개로 용액을 쪼개서 놓습니다. 그러면 두 번째 그림처럼, 오일 방울 안에 핵산이 들어가 있는 경우와  핵산이 전혀 없는 경우로 오일 방울들이 만들어질 것입니다. Denaturation-Annealing-Extension의 PCR 온도 단계 거쳐 방울 안에 있는 핵산들이 증폭을 진행하게 되면 형광 분자들이 끼어들어가 형광을 띄게 됩니다. 핵산이 있었던 오일 방울에는 형광이 나타날 것이고, 핵산이 없는 오일 방울에는 형광이 나타나지 않을 것입니다. 그래서 0,1,0,1과 같은 이분법처럼 형광을 띄는 오일 방울을 1로, 형광을 띄지 않는 오일 방울을 0으로 디지털 신호를 받아들여 개수를 센 뒤, poisson 분포를 통해 DNA의 수를 계산하면 됩니다. 이때 poisson 분포는 확률론의 명칭으로 단위 시간 안에 어떤 사건이 몇 번 발생할 것인지를 표현하는 이산 확률 분포입니다.

 

2세대 PCR에 비해 1000배가량 높은 민감도를 갖으며 복잡한 혼합물 상태에서도 타깃 유전자 분석이 용이합니다. 표준 곡선도 필요 없고, 효율에 의해 생기는 오차가 거의 없어 복제수 변이와 같이 희귀 돌연변이 검출 및 정량, 박테리아 바이러스의 절대적인 정량 연구에 많이 사용됩니다.