PCR & RT-PCR의 정의와 역사

어서 오세요~ 힐링 만다린입니다 :)

 

<쥬라기 공원> 영화에서 호박 속 모기 혈액 속에 공룡 DNA를 채취하여 도롱뇽 알에 넣은 뒤, 공룡을 복원하는 장면을 보신 적이 있으실 겁니다. 어떻게 손톱만 한 크기의 모기에서 채취한 DNA로 크나큰 공룡을 복원할 수 있었을까요? 모기의 DNA가 공룡을 만들기엔 정말 미량의 개수일 텐데 말이죠. 그래서 오늘은 DNA를 복제 및 증폭시킬 수 있는 분자생물학적 기술인 PCR에 대해 소개하고자 합니다.

 

PCR은 중합효소 연쇄 반응, 영어로는 Polymerase Chain Reaction이라 하여 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 기술입니다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있습니다. 증폭하는데 필요한 시간도 2시간 미만이고, 실험 과정도 어렵지 않으며, 다양한 기계들이 시중에 나와 자동적으로 증폭할 수 있기 때문에 PCR은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있습니다.

 

지금은 우리가 쉽게 PCR이라는 기술로 DNA를 증폭하고 있지만, 이 기술이 편리해지기까지는 여러 시행착오들이 있었습니다. 1984년 과학자 캐리 멀리스는 특정 DNA 서열을 증폭하기 위한 방법을 고안하여 이를 중합효소 연쇄 반응이라 불렀습니다. 1985년에 클레나우 중합효소를 이용한 PCR이 처음 공식적으로 발표되었는데, 단백질에 의해 만들어진 효소는 열에 약하기 때문에 실험 매 주기마다 새로 넣어 주어야 하는 불편함과 복제 가능한 최대 DNA의 길이가 400bp에 불과하다는 한계에 봉착하였습니다. (토마토의 게놈 사이즈가 900 mbp정도이니, 400bp는 토마토 한 조각도 분석하지 못하는 거겠죠?) 그래서 1988년 DNA 중합효소로 Thermophilus aquaticus라는 미생물(극 호열 균)의 Taq을 사용하여 열에 강하면서도 PCR의 효율을 월등히 끌어올렸습니다. 이 미생물은 우리가 흔히 들어본 옐로우스톤 국립공원의 온천과 온도가 높은 여러 지역에서 자라는 생물입니다. 요즘에는 반응의 결과를 더욱더 극대화하기 위해 Taq 중합효소뿐만 아니라 여러 회사들에서 독자적으로 개발한 복합 효소를 사용하기도 합니다.

 

초기 PCR 때, 매 주기마다 열에 약한 효소들을 새로 주입했다는 말처럼, PCR에는 일련의 세 개의 단계가 있고 30~40회 정도 반복되는 cycle을 수행합니다. 이런 단계를 거치기 위해서는 다음과 같은 것들이 준비되어야 합니다. 과학자가 원하는 유전자 부분을 포함한 주형 DNA(복제할 DNA)와 DNA 복제를 시작하기 위한 짧은 가닥의 RNA 조각 시발체, 프라이머, 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 과정에서 가열과 냉각이 반복되기 때문에 열에 강하고, DNA를 복제시켜줄 수 있는 매개체, DNA 중합효소, 또 이런 효소가 활성을 얻는데 필요한 DNA 중합효소용 완충용액, 마지막으로 dNTP라는 3개의 인산이 결합된 디옥시리보 뉴클레오타이드입니다. 이는 DNA를 구성하는 핵 염기인 구아닌, 시토신, 티민, 아민과 같이 합성에 필요한 4가지 염기의 뉴클레오타이드입니다.

 

이 재료들을 갖고, PCR이 시작됩니다.

PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 단계입니다. 두 가닥이 꼬여 있는 DNA를 가열함으로써 한 가닥씩 분리시키는 것인데요. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 됩니다. 변성 온도는 DNA 내에 있는 핵 염기 구아닌(G)과 시토신(C)의 양 그리고 DNA의 길이에 따라 달라지게 됩니다. 대체적으로는 92°C ~ 95°C로 가열하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리시킵니다.

PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)입니다. 이 단계에서는 프라이머라는 짧은 RNA 가닥의 시발체가 주형 DNA에 결합하게 되면서 PCR의 DNA 증폭을 시작시켜줍니다. 50°C ~ 65 °C에 진행되며, 프라이머가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA에 결합하게 되는데, 여기서, 결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소입니다. 만약 온도를 너무 높게 하면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어집니다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 프라이머가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있습니다. 따라서 주형 DNA와 프라이머가 가장 잘 결합할 수 있도록 최적의 온도를 만들어주는 것이 실험의 효율을 높여주는데 먼저 거쳐야 할 작업입니다. 염기 간의 결합은 구아닌(G)과 시토신(C)이 세 군데에서 수소결합이 일어나고, 아민(A)과 티민(T)은 두 군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강합니다. 따라서 G+C 비율에 따라 결합 온도에 변화를 주는 것이 좋으며, 일반적으로 G-C 가 50%가 되는 프라이머를 이용하는 것이 바람직합니다. 보통 30초가량 지속되는데 이 단계에서 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작됩니다.

PCR의 세 번째 단계는 신장(Elongation) 단계입니다. 이 단계에서는 열에 강한 DNA 중합효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 됩니다. 대게 70°C ~ 74 °C에 진행되며,  원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응 효소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있습니다.  이 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 20∼40회) DNA의 원하는 부분을 증폭시키는 것이 PCR의 원리입니다. 원하는 부분이 제대로 증폭되었는지 확인하기 위해서는 PCR산물의 크기를 비교할 수 있는 아가로스겔 전기영동을 이용하는 것이 일반적입니다. PCR산물의 크기는 DNA ladder라 불리는 것과의 비교를 통해 대략적으로 알 수 있습니다.

 

 

PCR은 DNA와 RNA수준의 PCR로 나뉠 수 있습니다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것이 아닌 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적입니다. 하지만 DNA를 바로 PCR 하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고 진핵 생물의 경우, 인트론( Intron; 비 발현 부위)이 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있습니다. 그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 프라이머를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA수준에서 하는 역전사-중합효소반응( RT(Reverse Transcriptase)-PCR)이 나오게 되었습니다. 

 

RT-PCR은 현재 분자생물학 분야에서 RNA 수준의 유전자 발현과 DNA cloning에 널리 이용되고 있습니다. 쉽게 설명드리자면, DNA에서 RNA로 가는 과정을 전사(transcription)라 하였는데, 이 기술은 전사 과정을 반대로 역전사 시켜, RNA를 DNA로 만든 다음, 생성된 cDNA를 증폭시키는 PCR 기술입니다. 역전사를 시키는 과정에서도 DNA 중합효소와 같이 RTase라는 효소를 이용해 RNA를 주형으로 상보적인 cDNA가 합성됩니다. 대부분 42℃에서 1시간 정도 진행되며, 사용하는 이유나 필요성에 따라 온도와 시간은 바뀌게 됩니다. DNA를 신장시켜줄 때 필요한 시발체, 프라이머와 같이 역전사 반응에서도 프라이머가 사용됩니다. 목적에 따라 특정 염기 서열에 대한 상보적인 프라이머, 랜덤 하게 구성되어 있는 6 mer 프라이머, oligo(dT) 12~18 프라이머가 사용됩니다. 임상 진단이나 정량 정성 반응에 대한 결과를 확인하고자 할 때는 선택적으로 특정 염기서열을 증폭할 필요가 있으므로 특정 염기서열에 대한 상보적인 primer를 이용합니다. 랜덤 6 mer 프라이머의 경우는 역전사 반응으로 신장되기 힘든 영역의 해석이나 임상진단에 있어 타겟으로 하는 염기서열이 짧아야 되는 경우 사용됩니다. oligo(dT) 12~18 프라이머는 전체 DNA를 얻고자 하는 경우에 유용하게 사용되어집니다. 

 

이렇게, PCR은 현재 생물학에서 쓰이지 않는 곳이 없다고 해도 과언이 아닐 정도로 광범위하게 사용되고 있는 기술입니다. 근래 과학 수사나 친자 감별 등에 자주 이용되는 DNA 지문 분석(DNA fingerprinting) 역시 PCR 법을 이용해서 이루어진 것입니다. 생물학에서는 여러 유전병을 판별하기 위해서 인간 유전학에서 사용하는 경우가 있으며, 오래된 고생물이나 멸종 생물의 희소 DNA를 증폭하기 위해서도 이용됩니다. 분류학에서도 종 간의 DNA 비교를 위해 PCR법을 널리 이용하고 있으며, 분자생물학에서는 DNA나 RNA를 다루기 위해서 반드시 이용되는 매우 중요한 기술로 받아들여지고 있습니다. 최근 SF영화에서 자주 등장하는 소재, 복제인간도 PCR 기술법의 DNA 복제에 영감을 받아 등장하게 된 건 아닐까요?

 

그럼, 오늘 하루도 힐링하세요 :)